RNA pulldown

RNA pulldown是体外研究RNA与蛋白质相互作用的重要实验技术。实验原理为体外转录合成生物素标记的目的RNA片段与细胞裂解物共孵育，获得能与目的RNA片段结合的蛋白质，随后洗脱不能结合或非特异结合的蛋白质，最后对分离纯化的蛋白进行WB或质谱分析。该技术广泛用于验证目的RNA与下游靶蛋白的结合，以及目的RNA与调控目的RNA蛋白质的结合。

技术流程概述：

1、体外转录制备目的RNA片段

以目标RNA为模板，体外转录合成与目的RNA序列一致的生物素标记RNA片段。

2、裂解细胞与去除DNA

组织先裂解重悬为单细胞悬液；裂解培养细胞或者组织细胞悬液，并用DNA酶消化内源性DNA，降低干扰。

3、生物素标记目的RNA片段预处理

1）生物素标记目的RNA片段变性后室温静置，形成自然二级结构

2）生物素标记目的RNA片段与偶联链霉亲和素的磁珠混合孵育，使生物素标记目的RNA片段与磁珠结合

4、Pulldown

将生物素标记目的RNA片段-磁珠复合物与去除DNA劣迹无共孵育，通过离心或磁力架分离纯化捕获生物素标记目的RNA片段获取目的RNA-蛋白质复合物。

5、洗脱与收集

洗脱琼脂糖微珠或磁珠，并收集与目的RNA结合的蛋白质。

6、检测与分析

收集与目的RNA结合的蛋白质后通过WB或质谱进行检测分析与目的RNA结合的蛋白质。

结果展示：

1、WB结果；

2、质谱结果。

客户提供的材料与信息：

1、RNA信息、待验证的结合蛋白信息等；

2、细胞样本，细胞量不低于3×10^7个细胞；

3、组织样本不低于1g。